引起昆虫ELISA试剂盒测定错误结果的原因有哪些

昆虫ELISA试剂盒方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。引起昆虫ELISA试剂盒测定错误结果的原因主要有：①标本因素;②试剂因素;③操作因素。下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。
1.样品稀释
酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。
2.试剂盒平衡
试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20——30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。
3.昆虫ELISA试剂盒样品和试剂的混匀
稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。
4.加样
在现在的ELISA试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性
5.温育
温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。
6.洗板
固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。
7.昆虫ELISA试剂盒边缘效应
使用96孔板的ELISA测定中，常发现有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。经研究证实在温育中的热力学梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身为不良热导体，在实验室的常规ELISA测定中，将板从室温（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板也升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。
8.显色
显色一定要控制时间，根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低;显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。
9.比色
比色要注意波长的选择。以TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而前者比色波长为450nm，后者为492nm，滤光片需根据要求随时更换。因此，容易出现滤光片错用的问题。
其次，单波长或双波长比色选择的问题。所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定;而双波长双色则酶标仪在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，敏感波上下的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和;非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。