规格:100T/96S
产品内容:
提取液:液体100mL×2瓶,4℃保存。试剂一:粉剂×1瓶,常温保存。
微量法
标准品:粉剂×1支,10mg单宁酸,4℃保存。临用前加入1.175mL提取液溶解为5000nmol/mL的标准液。
产品说明:
单宁又称植物多酚,是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物。单宁可作为潜在的生物标记物;与蛋白质结合的能力又称为收敛性或涩性。其收敛性是多种生理活性的基础,如止血、抗肿瘤、抗衰老等生理活性,也是影响产品口感的因素之一。
根据光谱特性,单宁在275nm下有较强的紫外吸收,通过利用活性炭能够特异吸附单宁的性质来检测单宁含量。
自备实验用品及仪器:
紫外分光光度计/酶标仪、离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板和蒸馏水。
测定操作:
1、样本处理:
将样本烘干至恒重,粉碎,过40目筛之后,称取约0.05g,加入1mL提取液,封口膜封口防止液体溅出,于70℃水浴提取30min,期间可摇晃数次。12000rpm,25℃,离心10min,取上清,用提取液定容至1mL,待测。
2、操作步骤:
(1)紫外分光光度计/酶标仪预热30min,波长调至275nm。蒸馏水调零。
(2)将5000nmol/mL标准液用提取液稀释为6.25、3.125、1.5625、0.78625、0.4、0.2nmol/mL标准溶液。
(3)加样表:
试剂名称 | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
试剂一 | 大约5-7mg | - | - | 大约5-7mg |
蒸馏水 | - | - | - | 0.5mL |
标准溶液 | - | - | 0.5mL | - |
样品 | 0.5mL | 0.5mL | - | - |
充分混匀震荡5min,13000g 离心20min。取200µL上清液测定275nm下的吸光度,分别记为A测定管、A对照管、A标准管、A空白管,计算∆A测定=A对照管-A测定管,A标准=A标准管-A空白管。
单宁含量计算:
1、标准曲线的绘制:
以标准溶液的浓度为x轴,以A标准为y轴,绘制标准曲线,得到方程y=kx+b,将∆A测定带入方程中得到x(nmol/mL)
2、单宁含量计算:
1. 按蛋白浓度计算:
单宁含量(nmol/mg prot)=x×V提取÷(V提取×Cpr) =x÷Cpr。
2. 按样本鲜重计算:
单 宁 含 量 (nmol/g 鲜 重 )=x×V 提 取 ÷W =x÷W 。Cpr: 样品蛋白浓度,mg/mL(蛋白浓度需重新用PBS提取测定);W:样品质量,g;V提取:
提取液体积,2mL。
注意事项:
1、 当∆A大于1.5时,建议将样品上清液用提取液稀释更大倍数后测量;∆A过小时,建议减少稀释倍数或增加样品质量来测定。