人胰岛素(INS)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书
实验原理 :
本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验 (ELISA) 。往预先包被有人胰岛素(INS) 捕获抗体的微孔中, 依次加入样本、标准品、生物素标记的检测抗体,HRP 酶结合物,中间经过温育和洗涤,用底物 TMB 显色,TMB 在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛素 (INS) 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度 (OD 值) ,计算样品浓度。
操作步骤 :
1. 从室温平衡 10 分钟后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 加样:分别将样品或不同浓度标准品按照 100 μ l 每孔加入相应孔中,空白孔加入 100μL 通用稀释液。盖 上封板膜后 37℃温育 1 小时。 (建议:将待测样本用通用稀释液稀释 1 倍后再加入酶标板内测试。从 而减少基质效应对测试结果的误差影响,最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释倍数。所有的待测样本和 标准品在检测中建议设立复孔) 。
3. 加生物素化抗体:取出酶标板,弃去液体,不用洗涤。每孔直接加入生物素化抗体工作液 100 μL,盖上封 板膜后 37℃温育 1 小时。
4. 洗板:弃去液体,每孔加入 300 μL 1x 洗涤液,静置 1 分钟,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板
3 次 (也可用洗板机洗板) 。
5. 加酶结合物工作液:每孔加入酶结合物工作液 100 μL,盖上封板膜后 37℃温育 30 分钟。
6. 洗板:弃去液体按步骤 4 洗涤方法,洗板 5 次。
7. 加底物:每孔加入底物(TMB)90 μL,盖上封板膜,37℃避光温育 15 分钟。
8. 加终止液:取出酶标板,每孔直接加入终止液 50 μL,立即在 450nm 波长处测定各孔的OD 值。
结果判断:
1. 计算标准品和样本复孔的平均 OD 值并减去空白孔的OD 值作为校正值。以浓度为横坐标,OD 值为纵坐标, 在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。
2. 若样品OD 值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。
典型数据和参考曲线:
以下数据和曲线仅供参考,实验者需根据自己的实验建立标准曲线。
浓度 (ng/mL) | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0.312 | 0. 156 | 0 |
OD 值 | 2.22 | 1.56 | 0.92 | 0.63 | 0.42 | 0.25 | 0. 18 | 0.08 |
校正 OD 值 | 2. 14 | 1.48 | 0.94 | 0.55 | 0.34 | 0. 17 | 0.1 |
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试剂盒性能 :
1. 重复性:板内变异系数小于 10%,板间变异系数小于 10%。
2. 回收率:在选取的健康人血清、血浆和组织匀浆中加入 3 个不同浓度水平的人 INS,计算回收率
样本类型 | 范围 | 平均回收率 |
血清 (n=8) | 84- 101 | 96 |
血浆(n=8) | 92- 105 | 102 |
细胞培养上清(n=8) | 96- 108 | 105 |
3. 线性稀释:分别在选取的 4 份健康人血清、血浆和组织匀浆中加入高浓度人 INS,在标准曲线动力学范围
内进行稀释,评估线性。评估线性。
本试剂盒只能用于科学研究,不得用于医学诊断 6
稀释比例 | 回收率 (%) | 血清 | 血浆 | 细 胞 培养 上 清 |
1 :2 | 范围 (%) | 84-95 | 88-96 | 90- 110 |
平均回收率 (%) | 91 | 93 | 96 | |
1 :4 | 范围 (%) | 89- 103 | 87- 108 | 105- 115 |
平均回收率 (%) | 94 | 98 | 108 |
注意事项:
1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温 20-25℃ 。使用
后立即冷藏保存试剂。
2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3. 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD 值。
4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6. 在储存和温育时避免强光直接照射。
7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂
的生物活性。
9. 不能使用过期产品。
10. 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。